该方法实现了三步信号扩增：(1)PCR扩增。

10mmol/L 乙酸铵 - 乙腈体系作为流动相时各目标物峰形窄而对称，保留时间适中。声明：本文所用图片、文字来源《中国食品添加剂》，版权归原作者所有。

2.2 方法学评价2.2.1 方法的线性范围、检出限和定量限方法的线性范围、检出限和定量限结果表明，7 种食品添加剂在各自的浓度范围内线性关系良好，相关系数（r2）均大于 0.995，检出限和定量限也能满足对植物饮料检测的要求。总离子流色谱图如图 1 所示，7 种食品添加剂的提取离子流色谱图如图 2 所示2.3 实际样品的测定按所建立的方法对购自本地零售超市和商店的凉茶、冬瓜茶和菊花茶各 5 份共 15 份样品进行检测，每个样品重复测定 2 次。该方法前处理简单、选择性好、灵敏度高，适合大批量植物饮料中 3 种防腐剂及 4 种合成甜味剂的定性筛查和定量分析，为食品安全监测提供技术支持。虽然安赛蜜、苯甲酸，山梨酸、脱氢乙酸和糖精钠未能达到基线分离，但也可以通过质谱离子对选择通道实现定性定量分析，各离子对互不干扰。

2.1.2 色谱条件的优化本研究分别考察了以超纯水、0.1% 甲酸 -水、10mmol/L 乙酸铵水溶液作为水相，以甲醇、乙腈作为有机相的分离效果。2.2 方法学评价2.2.1 方法的线性范围、检出限和定量限方法的线性范围、检出限和定量限结果表明，7 种食品添加剂在各自的浓度范围内线性关系良好，相关系数（r2）均大于 0.995，检出限和定量限也能满足对植物饮料检测的要求。下面主要对氯仿萃取比色法作详细阐述。

其他条件按仪器说明调至最佳状态。5、结果计算 式中：X在标准曲线中查得的测定用样品溶液中碘含量，g。当用氯仿萃取时，碘溶于氯仿中呈粉红色，当碘含量低时，颜色深浅与碘的含量成正比，与标准系列比较定量。(4)样品测定：根据样品含碘量高低，吸取数毫升样品溶液置于125mL分液漏斗中，以下按(3)自加水至总体积为40mL起依法操作，在波长510nm处测定样品溶液吸光度值，与标准系列比较定量(g)。

此溶液每毫升含碘100g。②本法操作简便，显色稳定，重现性好。

用lcm比色皿在波长510nm处测定吸光度值，绘制标准曲线。②茜素氨羧配位剂溶液、硝酸镧溶液、氟标准储备液、氟标准使用液，应在冰箱中保存这是因为蛋白酶只有在一定的pH区间内具有较高的活性，当蛋白酶处于过酸或过碱的条件下时蛋白酶的结构会被破坏，导致部分蛋白无法完全水解，疏水基团未完全暴露，使得生成肽的抗氧化涪陛降低。由上图可知，当pH在7.0～9.0时，DPPH的清除率随着pH的增大逐渐增大，当pH为9.00时，DPPH清除率达到最大值，为43.89％。

（2）绿豆多肽抗氧化性与酶浓度的关系参照于慧等人的方法进行DPPH自由基清除率的测定。将上述过程中的2mLDPPH溶液用无水乙醇取代，然后与2mL绿豆多肽溶液进行反应，此条件下测定吸光值记录为Aj，将2mL无水乙醇与2mLDPPH溶液反应的条件作为空白组，此时记录吸光值为Ao。（4）绿豆多肽抗氧化性与酶解时间的关系通过单因素实验的结果，可以筛选出各因素的三个水平。当pH超过9.0时，DPPH清除率逐渐减小。

将2mL一定浓度的绿豆多肽溶液和2mL的0.12mm01L-1DPPH溶液进行混合，避光于25℃条件下反应30min，取出后于517nm波长下进行吸光值的测定，此时吸光度值记录为Ai。改变反应pH，结果见3所示。

当底物的浓度维持不变，有效酶浓度逐渐增多，从而起到抑制作用，使酶水解的不彻底，故水解得到的抗氧化肽减少，进而导致DPPH清除率降低。由图1可知，当酶解温度低于50℃，DPPH清除率与温度成正比，当温度超过50℃时，DPPH清除率开始下降。

由图2可知，当酶浓度低于6％时，DPPH清除率随着酶浓度的增加而增大，当酶浓度超过6％时，DPPH清除率随着酶浓度的升高而降低。这是因为蛋白酶对稳定的要求较高，温度过低会影响酶解的反应速度，使酶解反应不彻底，从而影响抗氧化肽的抗氧化效果。声明：本文所用图片、文字来源《中国食品添加剂》，版权归原作者所有。（3）绿豆多肽抗氧化性与pH的关系本实验在于研究酶法对绿豆蛋白水解的抗氧化肽的工艺优化，故以DPPH为指标，选择酶解时间、酶解温度、酶添加量以及pH为因素进行单因素实验。待溶液冷却至酶解最适温度，水浴保温，向溶液中加入0.5mol／L的NaOH调节其pH，酶解一段时间后100℃水浴灭活10min，室温下离心(4000r／min，20min)，将上清液冻干后保存。二、结果与讨论1、单因素实验结果（1）绿豆多肽抗氧化性与酶解温度的关系将绿豆蛋白配置成一定浓度的溶液，水浴加热至100℃进行15min均质处理。

所以在此基础之上，应用统计分析软件建立4因素3水平的BoxBehnken模型，进行回应面优化设计。整体呈现先上升后下降的原因在于随着酶浓度的升高，有效酶浓度逐渐加大。

如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系相关链接：蛋白酶，乙醇，绿豆。而温度过高则会影响蛋白酶的活性，使蛋白酶的活性降低，无法使蛋白水解成具有抗氧化性的小分子肽段，从而使DPPH清除率降低。

（2）绿豆多肽抗氧化性与酶浓度的关系将2mL一定浓度的绿豆多肽溶液和2mL的0.12mm01L-1DPPH溶液进行混合，避光于25℃条件下反应30min，取出后于517nm波长下进行吸光值的测定，此时吸光度值记录为Ai。改变酶解时间结果见4所示。

实验条件进行实验，改变反应pH，结果见3所示当pH超过9.0时，DPPH清除率逐渐减小。将2mL一定浓度的绿豆多肽溶液和2mL的0.12mm01L-1DPPH溶液进行混合，避光于25℃条件下反应30min，取出后于517nm波长下进行吸光值的测定，此时吸光度值记录为Ai。这是因为蛋白酶只有在一定的pH区间内具有较高的活性，当蛋白酶处于过酸或过碱的条件下时蛋白酶的结构会被破坏，导致部分蛋白无法完全水解，疏水基团未完全暴露，使得生成肽的抗氧化涪陛降低。

由上图可知，当pH在7.0～9.0时，DPPH的清除率随着pH的增大逐渐增大，当pH为9.00时，DPPH清除率达到最大值，为43.89％。当底物的浓度维持不变，有效酶浓度逐渐增多，从而起到抑制作用，使酶水解的不彻底，故水解得到的抗氧化肽减少，进而导致DPPH清除率降低。

如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系相关链接：蛋白酶，乙醇，绿豆。实验条件进行实验，改变反应pH，结果见3所示。

整体呈现先上升后下降的原因在于随着酶浓度的升高，有效酶浓度逐渐加大。这是因为蛋白酶对稳定的要求较高，温度过低会影响酶解的反应速度，使酶解反应不彻底，从而影响抗氧化肽的抗氧化效果。

改变反应pH，结果见3所示。由图2可知，当酶浓度低于6％时，DPPH清除率随着酶浓度的增加而增大，当酶浓度超过6％时，DPPH清除率随着酶浓度的升高而降低。将上述过程中的2mLDPPH溶液用无水乙醇取代，然后与2mL绿豆多肽溶液进行反应，此条件下测定吸光值记录为Aj，将2mL无水乙醇与2mLDPPH溶液反应的条件作为空白组，此时记录吸光值为Ao。（3）绿豆多肽抗氧化性与pH的关系本实验在于研究酶法对绿豆蛋白水解的抗氧化肽的工艺优化，故以DPPH为指标，选择酶解时间、酶解温度、酶添加量以及pH为因素进行单因素实验。

（2）绿豆多肽抗氧化性与酶浓度的关系将2mL一定浓度的绿豆多肽溶液和2mL的0.12mm01L-1DPPH溶液进行混合，避光于25℃条件下反应30min，取出后于517nm波长下进行吸光值的测定，此时吸光度值记录为Ai。所以在此基础之上，应用统计分析软件建立4因素3水平的BoxBehnken模型，进行回应面优化设计。

声明：本文所用图片、文字来源《中国食品添加剂》，版权归原作者所有。改变酶解时间结果见4所示。

待溶液冷却至酶解最适温度，水浴保温，向溶液中加入0.5mol／L的NaOH调节其pH，酶解一段时间后100℃水浴灭活10min，室温下离心(4000r／min，20min)，将上清液冻干后保存。（4）绿豆多肽抗氧化性与酶解时间的关系通过单因素实验的结果，可以筛选出各因素的三个水平。